在生物领域中，越来越多的研究人员开始使用能谱（EDS）技术对生物材料进行元素分析，但对一些刚接触该设备的生物学家来说仍然可能是一个挑战。最初，EDS在生物电子显微学中应用非常狭窄，但近年来，随着无窗型能谱检测器技术的发展和扫描电镜低加速电压性能的提升，EDS在生物样品中的应用呈指数增长，但生物样品的制备仍然是制约SEM-EDS分析的壁垒之一，在此我们将与您分享一些制样及使用技巧。

1. 平整的表面和超薄切片

EDS探测器位于SEM样品室的一侧，若样品表面粗糙不平在进行EDS分析时会产生阴影效应。故推荐做EDS分析的样品表面尽量相对平坦。有些样品，如具有自然平坦结构的叶片表面可以直接分析，其他样品则需要制备以获得平坦的表面。细胞和内部组织结构可以通过包埋、平整表面制备或切片后放置在钉台或网格上进行分析。在所有制备方案中，首选切片样品，因为其稳定性高，且可在透射电子显微镜（TEM）和扫描电子显微镜（SEM）进行分析。水合冷冻样品也可以用冷冻超薄切片或冷冻切削技术制备。

2. 根据具体需要选择适合的制样方式

样品的制备在固定和包埋过程中添加的对比剂可能会影响样品中元素的定位和能谱检测结果。冷冻样品和未染色样品可以更好地分析样品中本身元素的位置，而染色样品可以提供有关样品的结构和功能信息。如果对样品中某个元素感兴趣，首先需要查看该元素的特征X射线能量，是否与染色剂中元素（如Os）的特征X射线能量重叠，如果重叠，需要考虑是否可以在样品制备过程中不染色或者选择其它染色剂。

表面喷碳对于生物样品的SEM-EDS分析非常重要，可以提高样品表面导电性，缓解放电情况。对于切片样品来说，可以直接固定到钉台上使用低加速电压进行分析而无需喷碳；如果需要将切片放置在其他基板上，可在此之前对基板做喷碳处理。对于块状的包埋样品或干燥样品来说，需要表面喷碳，厚度约5-20nm（取决于样品），同时也应尽可能控制样品的尺寸，越小越好；将样品固定至样品台上，可以选择导电环氧树脂或碳导电胶；在样品或树脂块的边缘喷碳或涂上银漆也有助于提高导电性。碳涂层会吸收一些低能量的x射线，如氮的特征X射线，如果这些元素对您的分析至关重要，请使用其他类型的涂层或其他样品制备方法，如切片。

下图为由鼠耳芥叶片维管束中提取的细胞的TEM-EDS结果。样品利用乙醛固定后，进行脱水处理并使用LR White树脂进行包埋，最后切片，整个过程无任何染色处理。元素面分布图显示细胞的超微结构信息，细胞核（N）和液泡（V）清晰可见。图像是使用Ultim Max-TLE探测器和AZtecTEM软件拍摄的。TEM在200kV下以STEM模式工作，光斑尺寸为2，样品向EDS检测器倾斜20°，元素面分布图分辨率为1024像素。

3. 电镜条件

显微镜条件在所有电子显微分析中都至关重要： 首先，需要根据样品选择适当的观察条件。在进行TEM-EDS分析时，STEM的成像能力和光斑强度直接影响着结果的好坏。第二，需要将样品向EDS探测器倾转20度（通常为α角正20度）。第三，束斑大小的选择，束斑越大，产生的特征X射线信号越多，但也更容易对样品造成损伤，尤其对cryo-EM的分析更为严重。

利用扫描电镜（SEM）对生物样品进行分析时，通常会使用相对较低的加速电压（5kV或更低）来减少样品损伤并提高空间分辨率。这是因为加速电压（kV）直接影响电子束和样品的相互作用体积，加速电压越高，电子穿透得越深，产生二次电子和特征X射线信号的体积也就越大；相应地，降低电压会减少相互作用体积，提高空间分辨率。除加速电压外，在推荐的工作距离下采集信号也至关重要，这影响着探头的采集效率以及信噪比，对于Ultim Extreme来说，可以在4 mm下进行数据采集（该值与电镜型号有关，可以询问能谱安装工程师）。

样品中含有的元素和电镜加速电压决定了采集到的X射线种类和数量。在SEM-EDS中，如果需要定量，通常需要选择过压比约2.5倍的加速电压，即观察电压是定量元素特征X射线能量的2.5倍；如果只需要定性或者进行面分布采集，不必完全按照以上标准进行，通常来说，过压比1.5倍可以较好地激发元素特征X射线用于面分布/线分布扫描。增加束流或使用更大的聚光镜光阑孔径将有助于增加在低电压下产生的信号量。生物样品通常关注轻元素，且观察电压较低，而Ultim Extreme使用无窗设计和优化的物理构造大大提高轻元素检测能力的同时最大限度地保证了有效信号量，因此Ultim Extreme对于分析生物样品具有巨大的优势。

下图所示为5kV，1nA条件下利用Ultim Extreme观察到的冬青叶叶片的表面硫（粉红色）和硅（蓝色）的污染物。未避免污染物掉落，样品并未固定，而是仅进行干燥后就直接置于在样品台上，样品表面喷碳，边缘涂银漆。图像分辨率1024，总采集时间10 min。

4.采集

通过调整像素驻留时间，图像像素和处理时间等可以优化分析条件。对于某些样品来说，优化参数后信号量仍然非常低，这时，需要延长采集时间来获得细节更清晰的面分布图。需要采集整个样品还是局部取决于分析目的。如果是全新的样品，可能需要快速扫描大面积信息，找到感兴趣区域后，长时间扫描来获得局部细节信息。在扫描细节信息时，尽可能选择高放大倍率，获得更精细的元素信息。

在面分布过程中，应尽可能减少样品漂移。Aztec中的自动漂移矫正AutoLock功能可以帮助锁定扫描区域，获得正确的元素分布。这在生物样品分析时非常重要，因为生物样品大多数导电性不好，即使喷碳也会略有漂移，这时使用自动漂移矫正可以帮助获取精细元素分布；有些生物样品在观察图像时即使没有漂移，在扫描元素面分布时也建议使用自动漂移矫正功能，保证获得边界明锐的元素分布图。

Dr Louise Hughes
Life Science Product Manager